1.4.3 大鼠胫骨骨密度检测 采用双能X 射线骨密度仪检测各组大鼠左侧胫骨骨密度，严格按照仪器说明进行操作。

1.4.4 腰椎总蛋白制备 取腰椎样品加入适量SDT 裂解液，沸水浴后，离心取上清液提取蛋白质。采用 BCA 法进行蛋白质定量后-80 ℃保存。

1.4.5 TMT 标记及肽段分级 每个样品取适量蛋白质进行胰蛋白酶酶解，肽段定量(A280)。按照TMT 标记试剂盒说明书，每份样品分别取100 μg 肽段进行标记后等量混合再进行分级。首先采用乙腈和0.1%三氟乙酸(TFA)进行柱平衡，然后将混合的标记肽段样品上样，将其脱盐处理、梯度洗脱、真空干燥后用适量0.1%FA 复溶冻干样品，A280测定肽段浓度。

1.4.6 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 采用纳升流速的HPLC 液相系统Easy nLC 对每份分级样品进行分离；样品经色谱分离后用Q-Exactive 质谱仪进行质谱分析，正离子检测方式，母离子扫描范围300-1 800 m/z。多肽和多肽碎片的质量电荷比采集方式：每次全扫描后采集20 个碎片图谱(MS2 scan，HCD)。

1.4.7 蛋白质鉴定和定量分析 LC-MS/MS 质谱分析原始数据使用软件Mascot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4 进行查库鉴定及定量分析。蛋白数据库为：UNIPROT_Rattus_norvegicus__；定量方式根据唯一肽段定量值的中位数。最大漏切数2；可变修饰有Oxidation (M)，TMT6/10 plex(Y)，固定修饰Carbamidomethyl (C)，TMT6/10 plex(N-term)，TMT6/10 plex(K)；可信肽段的筛选标准≤0.01。

1.5 主要观察指标①差异表达蛋白；②Gene Ontology(GO)功能富集分析(Blast2Go 软件， Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG， 数据库，

1.6 统计学分析和生物信息学分析应用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计学处理，结果以±s表示，根据数据是否符合正态性检验，选择非参数检验；研究数据为多组间均数比较，采用单因素方差分析再进一步两两比较；P< 0.05 认为差异有显著性意义。差异蛋白筛选条件为：倍数变化 >1.2 倍且P< 0.05(上调 >1.2 倍或者下调 < 0.83)，符合条件进行后续GO、KEGG 通路、蛋白互作分析和展示。

2 结果 Results

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36 只，分为3 组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组大鼠胫骨骨密度比较与假手术组相比，模型组骨密度显著降低(P< 0.05)；与模型组相比，骨疏康组骨密度显著提高(P< 0.05)；骨疏康组与假手术组骨密度比较差异无显著性意义(P> 0.05)，见表1。

表1 ｜各组大鼠胫骨骨密度比较 (±s，n=12，g/cm2)Table 1 ｜Comparison of bone mineral density of the rat tibia among groups表注：与假手术组比较，aP< 0.05；与模型组比较，bP< 0.05组别 骨密度假手术组 0.模型组 0.骨疏康组 0.

2.3 蛋白质鉴定及差异表达蛋白质筛选在3 组中共鉴定到3 614 个蛋白质。以上述实验方法中提到的差异蛋白筛选条件为标准，进行了组间差异表达蛋白数目比较。模型组与假手术组相比，共有125 个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有76 个，下调的蛋白有49 个；与模型组相比，给予骨疏康治疗后，共有81 个差异表达蛋白质，其中上调的蛋白有32 个,下调的蛋白有49 个。蛋白质定量结果统计以火山图形式展示，见图1，2。

2.4 差异表达蛋白质GO 功能富集分析

2.4.1 去势手术后差异表达蛋白质GO 功能富集分析 将模型组与假手术组数据进行差异表达蛋白GO 基因功能注释及富集分析，结果发现他们主要包含细胞、细胞器、膜部分、胞外区域等细胞组分(cellular compoent，CC)；具有结合、结构分子活性、外切酶活性等分子功能(molecular function，MF)；并参与细胞过程、核转录mRNA 分解代谢过程、应激反应等生物过程(biological process，BP)，见图3。

2.4.2 骨疏康治疗后差异表达蛋白质GO 功能富集分析 将骨疏康组与模型组数据进行差异表达蛋白GO 基因功能注释及富集分析，结果发现他们主要包含细胞、细胞器部分、蛋白复合物、膜部分等细胞组分；具有核酸模板转录、RNA 生物合成等分子功能；并参与免疫球蛋白受体结合、血管内皮生长因子受体结合等生物过程，见图4。

2.5 差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析

2.5.1 去势手术后差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析 将模型组与假手术组数据进行差异表达蛋白富集分析，富集到KEGG pathway 共14 条，见图5。其中，富集程度显著性最高的有1 型糖尿病代谢、RNA 降解、嘌呤和叶绿素代谢、抗原加工和提呈、补体和凝血级联反应等重要通路。

2.5.2 骨疏康治疗后差异表达蛋白质KEGG 通路富集分析 将骨疏康组与模型组数据进行差异表达蛋白富集分析，富集到KEGG pathway 共3 条，包括酪氨酸代谢、JAK-STAT 信号通路、乙醇代谢等重要通路，见图6。

文章来源：《中国中医药图书情报杂志》 网址: http://www.zgzyytsqbzz.cn/qikandaodu/2021/0613/734.html